細胞培養實戰指南：如何做好細胞實驗？
細胞是生物體的基本結構和功能單位。
細胞培養是在人工環境下，將細胞種植或培養在培養皿或培養瓶中，提供適當的培養基和條件，使細胞能夠在體外持續生長和繁殖的過程。
細胞培養實驗中，有一些細節，對于高效地完成實驗十分重要。本期內
容，盤點細胞實驗“實戰”過程中的關鍵點。
實驗前準備
1、明確細胞身份
在實驗正式開始前，需要根據實驗目的，確定所需的細胞系。不同的細胞系在形態、生理、代謝和功能等方面有很大的差異。選擇適合研究目的的細胞系可以增加實驗的準確性和可靠性。
選擇來源靠譜的細胞系（細胞類型、細胞來源、細胞代數等信息），根據不同細胞來源，尋找相應的細胞培養資料，明確培養基種類、培養物添加量、培養條件（溫度、濕度、二氧化碳濃度）等。
2、實驗室環境清潔
在細胞實驗開始前，需要對細胞培養環境進行清潔消毒甚至是滅菌處理。儀器、培養室墻壁與地面、培養室空間都應采取對應的清潔措施。
3、準備實驗材料
選擇高品質的實驗耗材與試劑，盡可能選擇無菌化處理過后的，若非無菌級，則需自行滅菌后才可用于細胞培養。
胎牛血清是許多細胞培養實驗中一種重要的添加物。提供對維持細胞指數生長的激素，基礎培養基中沒有或量很少的營養物，以及主要的低分子營養物。還能夠提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調節它們所結合的物質活力。
ausbian進口特級胎牛血清，精選內毒素更低批次（≤3eu/ml），澳洲血源，是細胞典藏等重大項目十幾年的穩定供應品牌。新批次在試用前，提供試用服務，養細胞更放心。全程冷鏈運輸，減少反復凍融對胎牛血清品質的影響。
實驗過程
細胞復蘇
——液氮中取出的細胞，待液氮揮發后，馬上將細胞凍存管置于37℃水浴中輕輕搖動使快速融化（盡量控制在2min內，時間過長了可能會影響細胞的狀態）。在解凍時，凍存管瓶口盡量控制在水面以上。
——解凍后，將凍存管轉移到無菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。
——將細胞懸液轉移至，裝有37℃預熱的培養基離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，棄上清。
——重新加入經預熱培養基重懸細胞，以適宜密度，一般約為(3~5)×10^5個/ml密度接種到培養器皿（直徑10cm）中。放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。
細胞傳代
——用移液器吸取并丟棄使用過的細胞培養基（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導致易污染），并用pbs緩慢沖洗細胞2次。
——以直徑10cm的培養皿為例，向培養皿中加入500μl胰蛋白酶-edta（根據各細胞的使用說明，選擇合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養皿，使消化液流遍所有細胞表面，放到37℃孵育（一般2分鐘左右即可）。鏡下觀察，發現胞質回縮、細胞間隙增大，傾斜培養瓶時細胞層能自然流即可終止，此時應加入2-3ml含血清的培養液終止消化（細胞的解離時間標準可能偏差，根據細胞來源確定，有些細胞屬于半貼壁，無需胰蛋白酶也可解離）。
——吸取所有培養皿內的液體，沿培養皿底部緩慢吹打，重復該動作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個懸液（吹打過程中應盡量避免氣泡的產生）。
——把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后棄上清。
——加入培養基重懸成單細胞懸液。按實驗所需的細胞量添加到新的培養皿中，將培養皿37 ℃孵育，每天觀察細胞的貼壁情況。
注意：向培養皿加液體時，建議從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數次，最后移棄沖洗液。若是懸浮細胞傳代培養，過程中省消化步驟。
細胞凍存
——按照“細胞傳代”中的步驟收集細胞。
——加入細胞凍存液（一般10%dmso+對應細胞的培養基），重懸細胞，使細胞的終密度為(5~10)×10^5個/ml，移入細胞凍存管中。
——程序降溫，更推薦使用程序降溫盒。若手動進行降溫，凍存的一般程序為降溫速度1～2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可將降溫速度增加至5℃～10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。
污染控制
1、設備的清潔與滅菌
在開始任何細胞培養實驗之前，必須對所有設備、耗材和試劑進行滅菌處理，當然，我們推薦實驗人員盡量選擇商品化的無菌試劑。
滅菌方法包括高壓滅菌、過濾、紫外線照射、乙醇噴灑或擦拭、消毒清潔試劑噴灑或擦拭等。
2、環境的清潔與滅菌
所有細胞培養工作應在無菌和清潔的環境中進行。因此要對實驗環境進行清潔與滅菌。
包括實驗前對實驗空間定期清潔，包括桌面、地面、墻面、生物安全柜操作臺等，開始實驗前，還應打開生物安全柜中的紫外線燈進行照射滅菌。
除了常規的消毒試劑，這里推薦使用德國minerva biolabs的mycoplasma-off支原體祛除噴霧劑，不僅對支原體起作用，還能高效清除并預防細菌、真菌等污染物。水浴鍋、培養箱水槽等環境，可以添加water shield™，有效預防水源中的支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子的污染。
3、正確處理實驗材料
正確處理實驗材料，實驗操作應符合相關規定、避免交叉污染。包括佩戴適當的個人防護設備，如手套、口罩；及時更換移液器一次性器具等操作。
4、實驗室合理布局
在實驗過程中，嚴格遵守實驗室中物品擺放準則，以培養箱舉例：培養皿擺放密度應合理，宜少不宜多等。
5、定期監測培養物
定期監測培養物，對于及早發現和解決而言，也是一個關鍵點。這包括在顯微鏡下檢查培養物狀態、肉眼觀察培養基的形態、顏色等變化等。必要時可以使用pcr技術定期測試微生物污染的存在。
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選擇來源靠譜的細胞系（細胞類型、細胞來源、細胞代數等信息），根據不同細胞來源，尋找相應的細胞培養資料，明確培養基種類、培養物添加量、培養條件（溫度、濕度、二氧化碳濃度）等。
2、實驗室環境清潔
在細胞實驗開始前，需要對細胞培養環境進行清潔消毒甚至是滅菌處理。儀器、培養室墻壁與地面、培養室空間都應采取對應的清潔措施。
3、準備實驗材料
選擇高品質的實驗耗材與試劑，盡可能選擇無菌化處理過后的，若非無菌級，則需自行滅菌后才可用于細胞培養。
胎牛血清是許多細胞培養實驗中一種重要的添加物。提供對維持細胞指數生長的激素，基礎培養基中沒有或量很少的營養物，以及主要的低分子營養物。還能夠提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調節它們所結合的物質活力。
ausbian進口特級胎牛血清，精選內毒素更低批次（≤3eu/ml），澳洲血源，是細胞典藏等重大項目十幾年的穩定供應品牌。新批次在試用前，提供試用服務，養細胞更放心。全程冷鏈運輸，減少反復凍融對胎牛血清品質的影響。
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——解凍后，將凍存管轉移到無菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。
——將細胞懸液轉移至，裝有37℃預熱的培養基離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，棄上清。
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——用移液器吸取并丟棄使用過的細胞培養基（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導致易污染），并用pbs緩慢沖洗細胞2次。
——以直徑10cm的培養皿為例，向培養皿中加入500μl胰蛋白酶-edta（根據各細胞的使用說明，選擇合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養皿，使消化液流遍所有細胞表面，放到37℃孵育（一般2分鐘左右即可）。鏡下觀察，發現胞質回縮、細胞間隙增大，傾斜培養瓶時細胞層能自然流即可終止，此時應加入2-3ml含血清的培養液終止消化（細胞的解離時間標準可能偏差，根據細胞來源確定，有些細胞屬于半貼壁，無需胰蛋白酶也可解離）。
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——把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后棄上清。
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4、實驗室合理布局
在實驗過程中，嚴格遵守實驗室中物品擺放準則，以培養箱舉例：培養皿擺放密度應合理，宜少不宜多等。
5、定期監測培養物
定期監測培養物，對于及早發現和解決而言，也是一個關鍵點。這包括在顯微鏡下檢查培養物狀態、肉眼觀察培養基的形態、顏色等變化等。必要時可以使用pcr技術定期測試微生物污染的存在。
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